Life Med | 李墨等揭示小幅pH偏差诱导人类细胞转录组水平反应

2022年11月，阿卜杜拉国王科技大学 (King Abdullah University of Science and Technology, KAUST) 李墨、Carlos M Duarte课题组与索尔克研究所（Salk Institute for Biological Studies）Juan Carlos Izpisua Belmonte课题组合作在Life Medicine杂志在线发表了题为A Gas-only Bioreactor System Maintains Stable Culture Environments and Reveals that Moderate pH deviations Trigger Transcriptome-wide Responses in Human Cells Cultured in Physioxia and Physiological Buffers的研究论文，介绍了他们开发的一种有助于创造更接近人类细胞真实生理环境的新的细胞培养技术。

哺乳动物通过内稳态机理调节体液的酸碱平衡，将 pH 值维持在一个狭小范围内以维持细胞的最佳功能。在体外细胞培养过程中，细胞外 pH 由四个过程调节：大气/介质界面处的气体交换、介质缓冲能力、二氧化碳分压 (pCO2) 和细胞代谢。由于这些过程的相互作用，细胞培养环境的 pH 值很难控制在生理范围内。通常，人们通过使用包括外源缓冲液和 CO2 培养箱在内的标准化技术，试图在细胞培养过程中维持生理相关条件。然而，常规实验中pH经常偏离设定值，引发人们对这种不稳定性如何引入实验伪影并影响实验重复性的担忧。对此，既往的研究通常使用外源缓冲液（例如强酸强碱、非挥发性缓冲液）等来调节细胞培养过程中的pH条件。李墨、Carlos M Duarte，和Juan Carlos Izpisua Belmonte课题组近年来的合作研究指出这些常用技术常导致pH 值和其他参数的大幅波动，或可引起细胞生长动力学发生不可预测的变化，从而限制实验结果的生理相关性。

研究人员的新培养技术仅依靠使用气体输送和碳酸氢盐/CO2 生理缓冲系统即可连续监测和严格控制细胞环境，将pH 水平严格保持在 ± 0.013 单位 (SE) 内，并在长时间培养（数小时至数天）期间将pH水平维持在生理范围内。研究团队利用这种技术分析了人类 GM12878 细胞系在不同培养基 pH 水平（6.8、7.0、7.2 和 7.4）下培养 72 小时的结果，揭示了 pH 值的微小扰动如何促使人类细胞显著重新定位其基因表达谱。
团队修改了一标准生物反应器系统的自动控制脚本和气体鼓泡搅拌系统，仅使用气体和生理缓冲液来维持 pH 和生理氧浓度。当 pH 值分别高于或低于设定值时，自动反馈回路将通过鼓泡搅拌CO2 或 N2 来实现 pH 值控制；同样地，自动反馈回路通过使用鼓泡搅拌纯 O2以稳定维持 dO2；这些气体在仅用生理 CO2/HCO3- 缓冲系统缓冲的培养液中输送。与此同时，定制的扩散器将产生气体微泡，通过增加接触以加快气体在介质中的扩散速率。改进的生物反应器可以将整个实验过程稳定控制在特定的温度、pH 和 dO2 水平。随后，为了探究培养基 pH 值与生理值的偏差对人类细胞转录组的影响，团队在持续监测和严格控制反应器系统的情况下，在四种不同的 pH 水平（pH7.4，pH7.2，pH7和pH6.8）和稳定生理dO2水平(~85%)下培养GM12878细胞系，并于每 24 小时检查一次细胞性能和转录组反应。RNA-seq 数据表明，在生理 pH 条件下生长的细胞与经历低 pH 条件的细胞之间存在不同的转录组特征；随着 pH 值的降低，基因表达模式越来越偏离生理 pH 值。主成分分析、功能聚类分析和基因集富集分析（GSEA）揭示了不同pH培养条件下细胞基因表达的差异。研究发现，在pH7.4处理组中，与细胞分裂和核糖体生物发生相关的基因表达明显上调，包括 CDK4、CDK1 和 CDC6 在内的 G2/M细胞周期检查点特征基因是表达上调最高的基因之一，揭示了细胞在pH 7.4培养条件下显著的细胞周期特征；在pH6.8处理组中，与凋亡信号通路和细胞增殖负调节相关的基因表达明显上调，包括 IL1B、NFKBIA 和 RELB在内的TNFA signaling via NFKB特征基因持续表达上调，揭示了细胞在pH 6.8培养条件下显著的炎性特征。这一研究成果的诞生得益于 KAUST 红海研究中心和计算生物科学研究中心的海洋生物学家 Carlos Duarte教授与生物与环境科学与工程系的干细胞生物学家李墨教授之间独特的跨学科合作。它强调了细胞培养系统中环境条件的控制、监测和报告方面普遍存在的问题，通过使用纯氧气、二氧化碳、氮气和生理缓冲液实现了对 pH 值和其他培养因素精确且生理相关的控制，揭示了与炎症和新陈代谢相关的基因应对酸性环境表现出的稳固及协同的变化。研究成果中的新型生物反应器平台可在未来的生物医学研究中带来更准确、可解释和可重复的实验。这一平台可能适用于现有的基于气体的生物反应器系统中的干细胞的临床级扩增。通过依靠反馈控制回路来控制环境条件，该生物反应器方案还可用于长期培养快速酸化培养基的细胞（例如癌细胞），而不依赖传统于分批培养。本研究在严格控制的培养条件下发现的特征基因可以助力于研究 pH 值变化如何促成炎症和新陈代谢改变的机制。KAUST生物与环境科学与工程学院李墨副教授、KAUST红海研究中心和计算生物科学研究中心Carlos M Duarte教授，和索尔克生物研究所（Salk Institute for Biological Studies）现任Altos Labs圣迭戈科学研究院主任的Juan Carlos Izpisua Belmonte教授为该文共同通讯作者。KAUST红海研究中心博士生Silvia Arossa和生物与环境科学与工程学院博士生Samhan M. Alsolami为该文共同第一作者。点击最下方“阅读原文”，查看Life Medicine英文全文

英文全文链接：

https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnac056

引用本文：

Silvia Arossa, Samhan M Alsolami, Shannon G Klein, Yingzi Zhang, Gerardo Ramos-Mandujano, Alexandra Steckbauer, Anieka J Parry, Juan Carlos Izpisua Belmonte, Carlos M Duarte, Mo Li, A Gas-only Bioreactor System Maintains Stable Culture Environments and Reveals that Moderate pH deviations Trigger Transcriptome-wide Responses in Human Cells Cultured in Physioxia and Physiological Buffers, Life Medicine, 2022;, lnac056, https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnac056

参考文献：

Klein, S.G., Alsolami, S.M., Arossa, S. et al. In situ monitoring reveals cellular environmental instabilities in human pluripotent stem cell culture. Commun Biol 5, 119 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03065-w

Klein, S.G., Alsolami, S.M., Steckbauer, A. et al. A prevalent neglect of environmental control in mammalian cell culture calls for best practices. Nat Biomed Eng 5, 787–792 (2021). https://doi.org/10.1038/s41551-021-00775-0

作者简介

李墨

阿卜杜拉国王科技大学

阿卜杜拉国王科技大学（KAUST）生物与环境科学与工程学院副教授。本科毕业于北京大学生命科学院细胞与遗传专业；博士时期就读于美国佐治亚大学（University of Georgia）细胞生物学系；随后于索尔克生物研究所（Salk Institute for Biological Studies）Juan Carlos Izpisua Belmonte实验室接受博士后训练。他的实验室致力于利用多显能干细胞、体细胞重编程、和基因组编辑技术来研究疾病以及再生机理。李墨课题组近期利用自主开发的纳米孔测序技术揭示CRISPR/Cas9基因组编辑工具在人类干细胞中产生的意外大型插入或缺失突变，从而指出基因组编辑技术的潜在安全问题。李墨课题组近期参与了COVID-19研究，并开发出两项新冠病毒检测方法。李墨副教授至今在Nature, Cell，New England Journal of Medicine, Genome Biology等国际学术期刊发表论文60余篇。

Carlos Duarte

阿卜杜拉国王科技大学

Tarek Ahmed Juffali 红海生态研究讲席教授，阿卜杜拉国王科技大学（KAUST）红海研究中心和计算生物科学研究中心教授。生物海洋学和海洋生态学等多个分支领域的杰出领导者，海草草甸和沿海生态系统生态学领域的全球领先权威之一。Duarte 参加了从热带到两极的世界各地的研究探险，研究生态系统、生物地球化学循环、沿海系统、大型植物、微生物、海草和开阔海洋环流。Carlos Duarte 教授的研究涉及两个独立但互补的兴趣点：一个关于海洋生态系统的代谢和元素预算及其在空间中的连通性，另一个关于海洋栖息地的稳定性和动态以及生物多样性的维护，包括人口统计、空间占用和基因流动。他的研究处于地球与可持续性科学之间的接口，并越来越多地涉及跨学科组成部分。

Juan Carlos Izpisua Belmonte

索尔克研究所

组织稳态、再生和新型干细胞疗法领域的国际领导者，以其旨在改变生物医学的大胆研究方法而闻名。Izpisua Belmonte的团队开发了将人类细胞分化为各种细胞类型和类器官、以及培养胚胎的方法（包括非人类灵长类动物的胚胎），并生成了合成哺乳动物胚胎。他的团队开发了嵌合技术，允许不同物种胚胎内的人类细胞分化。这些研究连同他对组织/器官再生的细胞和分子基础的阐明，引领了人类器官生长和再生方面的创新。此外，他的团队发现，细胞编程可以重置细胞的衰老时钟，使器官再生和恢复活力，改善疾病进展，并延长哺乳动物的健康寿命。他的研究两次被选为年度十大科学突破，2018年被《时代》杂志评为“医疗保健领域最具影响力的 50 位领袖”之一，2022 年获得 Ogawa-Yamanaka 干细胞奖。他的团队的大量工作极大有助于实施新的临床策略以治疗人类遗传和表观遗传疾病、器官移植和再生，有望推出针对与年龄有关的疾病和延长健康寿命的新疗法。

制版：嘉明

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